Makalah Genetika Hutan                                                                                               Medan,   Mei 2020

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Dosen Penanggungjawab:
Ahmad Baiquni Rangkuti, S.Hut., M.Si. 

Oleh:

Martin Ricardo Simangunsong 

171201204

Budidaya Hutan 6

 

 

 

 

 

 

DEPARTEMEN BUDIDAYA HUTAN

FAKULTAS KEHUTANAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2020

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah ini tepat pada waktunya.  Adapun  makalah ini berjudul “Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Makalah ini merupakan tugas mata kuliah Genetika Hutan, Departemen Budidaya Hutan, Fakultas Kehutanan, Universitas Sumatera Utara.

Penulis Mengucapkan terima kasih kepada dosen pembimbing mata kuliah  Bapak Ahmad Baiquni Rangkuti, S.Hut., M.Si. yang telah memberikan pelajaran dan bimbingannya. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan makalah ini belum sempurna, baik dari materi maupun teknik penyajiannya, mengingat kurangnya pengetahuan dan pengalaman penulis. 

Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan juga saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan laporan ini Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu dalam penyelesaian laporan ini. Semoga makalah ini dapat bermanfaat dan menjadi sumber bagi pihak-pihak yang membutuhkan.

 

 

            Medan,   Mei 2020

 

                                     Penulis

  

 

DAFTAR ISI

  Hal

KATA PENGANTAR ...............................................................................................................................i

DAFTAR ISI.............................................................................................................................................ii

BAB I. PENDAHULUAN

            1.1 Latar Belakang  ........................................................................................................................1

            1.2 RumusanMasalah......................................................................................................................1

            1.3 Tujuan  .....................................................................................................................................1

BAB II. ISI

2.1 Definisi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).....................................................................2

2.2 Konsep Dasar Polymerase Chain Reaction (PCR)...................................................................2

2.3 Prinsip Kerja dari Polymerase Chain Reaction (PCR).............................................................3

2.4 Apa saja tahapan dari Polymerase Chain Reaction (PCR).......................................................4

 

BAB III. PENUTUP

            3.1 Kesimpulan...............................................................................................................................6

DAFTAR PUSTAKA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

                Asam Deoksiribonukleat (DNA) merupakan materi genetik yang membawa informasi genetik bagi seluruh makhluk hidup. DNA terdiri atas bagian yang mengkode genetik (ekson), bagian yang tidak mengkode genetik (intron) dan bagian yang mengatur regulasi genetik. Karena fungsinya yang membawa informasi genetik, DNA sangat berguna dalam identifikasi penyakit infeksius, kanker, kelainan genetik, bahkan forensik. Setelah tiga belas tahun lalu, Human Genome Project berhasil mencatat peranan gen-gen pada genom manusia, kini dunia medis memasuki era farmakogenomik untuk tercapainya personalized medicine. Pengobatan akan lebih tepat sasaran jika mengacu pada diagnosis molekuler. Diagnosis molekuler merupakan metode diagnosis yang bertujuan untuk memahami mekanisme molekuler suatu penyakit pada setiap individu pasien (personalized medicine/dentistry). Metode ini akan sangat menguntungkan dalam peningkatan keamanan penghantaran obat dan keefektivan terapi pada berbagai penyakit di masa mendatang (Feranisa, 2016). 

Keragaman genetik yang dihasilkan dari analisis DNA (Deoxyribonucleic Acid) juga berguna dalam penentuan hubungan kekerabatan antar individu atau populasi yang diteliti. Salah satu metode analisa keragaman yang banyak digunakan adalah dengan RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA). RAPD merupakan salah satu marka molekuler berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction) yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada tingkat interspesies maupun antarspesies. Dalam penggunaan teknik RAPD memiliki keunggulan diantaranya adalah murah dan relatif mudah dilakukan karena hanya memerlukan sejumlah kecil DNA. Penggunaan penanda RAPD memungkinkan untuk mendeteksi polimorfisme fragmen DNA yang diseleksi dengan menggunakan satu primer bersifat acak. Salah satu teknik yang banyak diaplikasikan dan telah  berkembang saat ini adalah PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan alat Thermal Cycler PCR yang mampu mengevaluasi  dan melakukan kuantifikasi secara langsung (Pranawaty dkk., 2012).

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa defenisi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

2. Bagaimana konsep dasar Polymerase Chain Reaction (PCR)?

3. Bagaimana prinsip kerja dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

4. Apa saja tahapan dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui defenisi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

2. Untuk mengetahui konsep dasar Polymerase Chain Reaction (PCR).

3. Untuk mengetahui prinsip kerja dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

4. Untuk mengetahui tahapan dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

BAB II

ISI

2.1 Definisi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

Polymerase chain reaction ( PCR ) adalah metode yang banyak digunakan dalam biologi molekuler untuk secara cepat menghasilkan jutaan hingga miliaran salinan sampel DNA tertentu, yang memungkinkan para ilmuwan mengambil sampel DNA yang sangat kecil dan menguatkannya ke jumlah yang cukup besar untuk dipelajari secara terperinci. PCR ditemukan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Amerika Kary Mullis di Cetus Corporation . Ini penting untuk banyak pengujian genetik termasuk analisis sampel DNA purba dan identifikasi agen infeksi. Dengan menggunakan PCR, salinan sekuens DNA dalam jumlah sangat kecil secara eksponensial diperkuat dalam serangkaian atau siklus perubahan suhu. PCR sekarang merupakan teknik umum dan sering sangat diperlukan yang digunakan dalam laboratorium medis dan penelitian laboratorium klinis untuk berbagai aplikasi termasuk penelitian biomedis dan forensik kriminal. Sebagian besar metode PCR mengandalkan siklus termal . Siklus termal memaparkan reaktan ke siklus berulang pemanasan dan pendinginan untuk memungkinkan berbagai reaksi yang bergantung pada suhu khususnya pencairan DNA dan replikasi DNA yang digerakkan oleh enzim . PCR menggunakan dua reagen utama - primer (yang merupakan fragmen DNA untai tunggal pendek yang dikenal sebagai oligonukleotida yang merupakan sekuens komplementer untuk wilayah DNA target) dan DNA polimerase.

2.2 Konsep Dasar Polymerase Chain Reaction (PCR).

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Kemajuan di bidang biologi molekuler telah menghadirkan beberapa teknik yang dapat digunakan untuk deteksi dan identifikasi virus, salah satunya adalah Polymerase Chain Reaction (PCR). Teknik ini sangat sensitif dan spesifik untuk deteksi dan identifikasi patogen-patogen tanaman. Teknik PCR juga dapat digunakan untuk mengetahui mengenai komposisi populasi patogen dan diversitas genetik virus.

PCR menguatkan wilayah spesifik untai DNA (target DNA). Sebagian besar metode PCR memperkuat fragmen DNA antara 0,1 dan 10 kilo pasangan basa (kbp) panjangnya, meskipun beberapa teknik memungkinkan untuk amplifikasi fragmen hingga 40 kbp. Jumlah produk yang diperkuat ditentukan oleh substrat yang tersedia dalam reaksi, yang menjadi terbatas ketika reaksi berlangsung. Pengaturan PCR dasar memerlukan beberapa komponen dan reagen, termasuk:

·         templat DNA yang berisi wilayah target DNA untuk diperkuat

·         DNA polimerase ; enzim yang mempolimerisasi untai DNA baru; polimerase Taq tahan panas sangat umum, karena lebih cenderung tetap utuh selama proses denaturasi DNA suhu tinggi

·         dua primer DNA yang melengkapi ujung 3 ' (tiga prima) dari masing-masing helai indera dan anti-indra dari target DNA (DNA polimerase hanya dapat mengikat dan memanjang dari daerah DNA beruntai ganda; tanpa primer di sana) tidak ada situs inisiasi untai ganda di mana polimerase dapat mengikat) primer spesifik yang melengkapi wilayah target DNA dipilih sebelumnya, dan sering dibuat khusus di laboratorium atau dibeli dari pemasok biokimia komersial.

·         deoxynucleoside triphosphate , atau dNTPs (kadang-kadang disebut "deoxynucleotide triphosphate"; nukleotida yang mengandung kelompok trifosfat), blok bangunan tempat DNA polimerase mensintesis untai DNA baru

·         solusi penyangga yang menyediakan lingkungan kimia yang cocok untuk aktivitas dan stabilitas optimal dari DNA polimerase

·       kation bivalen , biasanya ion magnesium (Mg) atau mangan (Mn); Mg ²⁺ adalah yang paling umum, tetapi Mn ²⁺ dapat digunakan untuk mutagenesis DNA yang dimediasi PCR , karena konsentrasi Mn ²⁺ yang lebih tinggi meningkatkan tingkat kesalahan selama sintesis DNA dan kation monovalen , biasanya ion kalium (K).

2.3 Prinsip Kerja dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian 20-40 perubahan suhu berulang, yang disebut siklus termal, dengan setiap siklus biasanya terdiri dari dua atau tiga langkah suhu diskrit (lihat gambar di bawah). Siklus sering didahului oleh satu langkah suhu tunggal pada suhu yang sangat tinggi (> 90 ° C (194 ° F)), dan diikuti oleh satu penahan di ujungnya untuk perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan lamanya waktu mereka diterapkan dalam setiap siklus tergantung pada berbagai parameter, termasuk enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion bivalen dan dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh ( T _m ) dari primer. Langkah-langkah individual yang umum untuk sebagian besar metode PCR adalah sebagai berikut:

·         Inisialisasi : Langkah ini hanya diperlukan untuk DNA polimerase yang memerlukan aktivasi panas oleh PCR yang baru mulai. Terdiri dari memanaskan ruang reaksi hingga suhu 94-96 ° C (201-205 ° F), atau 98 ° C (208 ° F) jika polimerase yang sangat termostabil digunakan, yang kemudian ditahan selama 1– 10 menit.

·         Denaturasi : Langkah ini adalah acara bersepeda reguler pertama dan terdiri dari memanaskan ruang reaksi hingga 94-98 ° C (201-208 ° F) selama 20–30 detik. Ini menyebabkan peleburan DNA , atau denaturasi, dari templat DNA untai ganda dengan memutus ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan dua molekul DNA untai tunggal.

·         Annealing : Pada langkah berikutnya, suhu reaksi diturunkan menjadi 50-65 ° C (122-149 ° F) selama 20-40 detik, memungkinkan anil primer untuk masing-masing templat DNA untai tunggal. Dua primer yang berbeda biasanya dimasukkan dalam campuran reaksi: satu untuk masing-masing dari dua pelengkap beruntai tunggal yang mengandung daerah target. Primer adalah urutan untai tunggal sendiri, tetapi jauh lebih pendek dari panjang wilayah target, hanya melengkapi urutan sangat pendek di ujung 3 'dari setiap untai. Sangat penting untuk menentukan suhu yang tepat untuk langkah anil karena efisiensi dan spesifisitas sangat dipengaruhi oleh suhu anil. Suhu ini harus cukup rendah untuk memungkinkan hibridisasi primer ke untai, tetapi cukup tinggi untuk hibridisasi menjadi spesifik, yaitu primer harus mengikat hanya pada bagian komplemen sempurna dari untai, dan tidak di tempat lain. Jika suhunya terlalu rendah, primer dapat mengikat secara tidak sempurna. Jika terlalu tinggi, primer mungkin tidak mengikat sama sekali. Temperatur anil yang khas adalah sekitar 3-5 ° C di bawah _Tm dari primer yang digunakan. Ikatan hidrogen yang stabil antara basa komplementer terbentuk hanya ketika urutan primer sangat cocok dengan urutan template. Selama langkah ini, polimerase berikatan dengan hibrid primer-templat dan memulai pembentukan DNA.

·         Ekstensi / perpanjangan : Suhu pada langkah ini tergantung pada DNA polimerase yang digunakan; suhu aktivitas optimal untuk polimerase DNA termostabil dari Taq (Thermus aquaticus) polimerase adalah sekitar 75-80 ° C (167-176 ° F), meskipun suhu 72 ° C (162 ° F) adalah umum digunakan dengan enzim ini. Pada langkah ini, DNA polimerase mensintesis untai DNA baru yang saling melengkapi dengan untai templat DNA dengan menambahkan dNTPs bebas dari campuran reaksi yang komplementer dengan templat dalam arah 5'-ke-3 ', mengkondensasi gugus 5'- fosfat dari dNTPs dengan gugus 3'- hidroksi di ujung untai DNA yang baru lahir (memanjang). Waktu tepat yang diperlukan untuk perpanjangan tergantung pada DNA polimerase yang digunakan dan pada panjang daerah target DNA untuk diperkuat. Sebagai aturan praktis, pada suhu optimal, sebagian besar polimerase DNA mempolimerisasi seribu basa per menit. Dalam kondisi optimal (yaitu, jika tidak ada batasan karena membatasi substrat atau reagen), pada setiap langkah perpanjangan / perpanjangan, jumlah urutan target DNA menjadi dua kali lipat. Dengan setiap siklus yang berurutan, untaian templat asli ditambah semua untai yang baru dihasilkan menjadi untai templat untuk putaran perpanjangan berikutnya, yang mengarah ke amplifikasi eksponensial (geometris) dari wilayah target DNA spesifik. Proses denaturasi, anil dan perpanjangan merupakan satu siklus. Diperlukan beberapa siklus untuk memperkuat target DNA menjadi jutaan salinan. Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah salinan DNA yang terbentuk setelah sejumlah siklus tertentu adalah 2 ⁿ , di mana n adalah jumlah siklus. Jadi, reaksi yang ditetapkan untuk 30 siklus menghasilkan 230, atau 1.073.741.824, salinan dari daerah target DNA untai ganda asli.

·         Perpanjangan akhir : Langkah tunggal ini opsional, tetapi dilakukan pada suhu 70-74 ° C (158-165 ° F) (kisaran suhu yang diperlukan untuk aktivitas optimal sebagian besar polimerase yang digunakan dalam PCR) selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir untuk memastikan bahwa DNA untai tunggal yang tersisa sepenuhnya memanjang.

·         Penahanan terakhir : Langkah terakhir mendinginkan ruang reaksi hingga 4-15 ° C (39-59 ° F) untuk waktu yang tidak terbatas, dan dapat digunakan untuk penyimpanan jangka pendek produk PCR.

2.4. Apa saja tahapan dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

Seperti halnya reaksi kimia lainnya, laju reaksi dan efisiensi PCR dipengaruhi oleh faktor pembatas. Dengan demikian, seluruh proses PCR selanjutnya dapat dibagi menjadi tiga tahap berdasarkan kemajuan reaksi:

·         Amplifikasi eksponensial : Pada setiap siklus, jumlah produk digandakan (dengan asumsi efisiensi reaksi 100%). Setelah 30 siklus, satu salinan DNA dapat ditingkatkan hingga 1.000.000.000 (satu miliar) salinan. Maka, dalam arti tertentu, replikasi untai diskrit DNA sedang dimanipulasi dalam tabung di bawah kondisi yang terkendali. Reaksi ini sangat sensitif: hanya sejumlah kecil DNA yang harus ada.

·         Tahap meratakan : Reaksi melambat ketika DNA polimerase kehilangan aktivitas dan karena konsumsi reagen, seperti dNTP dan primer, menyebabkan mereka menjadi lebih terbatas.

·         Plateau : Tidak ada lagi produk yang terakumulasi karena kelelahan reagen dan enzim.

BAB III

PENUTUP

 

Kesimpulan

Polymerase chain reaction ( PCR ) adalah metode yang banyak digunakan dalam biologi molekuler untuk secara cepat menghasilkan jutaan hingga miliaran salinan sampel DNA tertentu, yang memungkinkan para ilmuwan mengambil sampel DNA yang sangat kecil dan menguatkannya ke jumlah yang cukup besar untuk dipelajari secara terperinci. PCR ditemukan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Amerika Kary Mullis di Cetus Corporation

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Kemajuan di bidang biologi molekuler telah menghadirkan beberapa teknik yang dapat digunakan untuk deteksi dan identifikasi virus, salah satunya adalah Polymerase Chain Reaction (PCR).

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR berdasarkan kemajuan reaksi:

·         Amplifikasi eksponensial : Pada setiap siklus, jumlah produk digandakan (dengan asumsi efisiensi reaksi 100%). Setelah 30 siklus, satu salinan DNA dapat ditingkatkan hingga 1.000.000.000 (satu miliar) salinan. Maka, dalam arti tertentu, replikasi untai diskrit DNA sedang dimanipulasi dalam tabung di bawah kondisi yang terkendali. Reaksi ini sangat sensitif: hanya sejumlah kecil DNA yang harus ada.

·         Tahap meratakan : Reaksi melambat ketika DNA polimerase kehilangan aktivitas dan karena konsumsi reagen, seperti dNTP dan primer, menyebabkan mereka menjadi lebih terbatas.

·         Plateau : Tidak ada lagi produk yang terakumulasi karena kelelahan

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Feranisa A. 2016. Komparasi antara polymerase chain reaction (pcr) dan loopmediated isothermal amplification (lamp) dalam diagnosis molekuler. ODONTO Dental Journal, 3 (2) : 145-146.

 

Handoyo D dan Rudiretna A. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Unitas. 9(1) : 17-29.

 

Pranawty., dkk. 2012. Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Konvensional dan Real Time PCR umtuk Deteksi White Spot Syndrome Virus pada Kepiting. Jurnal Kelautan dan Perikanan, 3 (4) : 62.

 

Santoso T J, Hidayat S H, Herman M, dan Sudarsono. 2013. Aplikasi Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Menggunakan Primer Degenerate dan Spesifik Gen AV1 Untuk Mendeteksi Begomovirus Pada Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.). J. Hort. Indonesia. 4(3) : 140-149.

 

Yusuf Z K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Saintek. 5(6).